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一体化细胞免疫荧光技术介绍
点击次数:2905 发布日期:2019-4-28  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)又称荧光抗体技术,是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
一.传统的免疫荧光实验步骤
(一)、实验材料 
1. 细胞样品 
2. 试剂、试剂盒: 多聚甲Quan;70% 甲醇;丙Tong;PBS;Triton ;BSA;DAPI 染液;DABCO;Tris;甘油   
3. 仪器、耗材:玻片     

(二)、实验步骤     
细胞爬片免疫荧光实验步骤 
第一天:
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用 PBS 浸洗 3 次,每次 3 min;

2. 用 4% 的多聚甲Quan固定爬片 15 min, PBS 浸洗玻片 3 次,每次 3 min;
3. 0.5%Triton X-100( PBS 配制 ) 室温通透 20 min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤);

4. PBS 浸洗玻片 3 次,每次 3 min,吸水纸吸干 PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室温封闭 30 min;

5. 吸水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒,4℃ 孵育过夜;

第二天:

6. 加荧光二抗: PBST 浸洗爬片 3 次,每次 3 min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中 20-37℃ 孵育 1 h,PBST 浸洗切片 3 次,每次 3 min;注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

7. 复染核:滴加 DAPI 避光孵育 5 min,对标本进行染核,PBST 5 min×4 次洗去多余的 DAPI;

8. 用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,然后在荧光显微镜下观察采集图像


二 传统免疫荧光实验主要问题

1. 爬片效果欠佳
2. 细胞和试剂用量大,成本高
3. 染液分布不均
4. 操作繁琐,费时费力

三. 一体化免疫荧光技术简介 
一体化的培养室-固定-染色-成像 免疫荧光的解决方案

技术特点:
1.快速简便的样品制备,一体化培养室简化了免疫荧光染色方案
2.均匀细胞分布,通道载玻片几何结构可以产生均匀的细胞分布
3.经济实惠的实验方案,需要少量的细胞和试剂
4.高分辨率成像,适用于宽场荧光,共焦成像,FRAP-FRET-FLIM和高质量的相差成像(Phase Contrast)
 
主要工作模式:
1. 
通道模式:ibidi通道载玻片是使用少量试剂的理想选择。μ-Slides VI0.4是一般免疫荧光检测的理想选择,而μ-Slide I0.4Luer可在低密度培养和流动实验中进行免疫荧光染色。

2.开放腔室模式
Ibidi μ-Slide 8 孔和μ-Dish35mm 能够在全内腔中实现标准免疫荧光方案,无盖玻片。染色后,使用高分辨率显微镜通过聚合物盖玻片底部观察样品。

 

3. 可拆卸腔室载玻片模式
带有腔室的可拆卸硅垫片为个体细胞培养和孵育提供了理想的模式。ibidi micro-Insert 4 Well可以使用极低的试剂量。可拆卸3Well|8Well|12 Well Chambers是长期样品储存的理想选择。

  1. 一体化免疫荧光技术应用举例
超过800篇参考文献证明了使用ibidi产品进行免疫荧光检测的优势

1. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) cultured under flow conditions in μ-Slide I 0.4 Luer

蓝色: nucleus (DAPI)
绿色: VE-cadherins (Alexa 488 conjugated antibody)
红色: actin cytoskeleton (Cy5 conjugated antibody)


2. Cell line Madin-Darby canine kidney (MDCK) cultured in μ-Slide VI 0.4

蓝色: nucleus (DAPI)
绿色: actin cytoskeleton (Alexa 488 conjugated antibody)
红色: mitochondria (MitoTracker)

3. Differentiated mouse fibroblasts cultured on elastic surface (ESS 28 kPa)

绿色: zyxin (Alexa 488 conjugated antibody)
红色: alpha-smooth muscle actin (Cy5 conjugated antibody)


产品技术参数表

五. 总结和评价
(1)这种腔式载玻片/培养皿,不需要包被,不需要爬片,培养细胞-冲洗玻片-固定细胞-染色-成像,所有步骤都在这个  载玻片就可以完成,直接镜检成像效果良好;
(2)如果希望做完实验还可以封片永久保存的,有这种可移除的腔式载玻片,3孔8孔12孔,根据实验需要选择,种好细胞染色之后,就可以撕掉框架,直接观察或者封片保存;
 (3)如果实验希望做小容量的,这种通道载玻片,跟普通免疫荧光实验对比,用枪加液和吸液就可以完成所有免疫荧光步骤,操作更简单;节省细胞节省试剂,一个通道只需要25微升液体;保证细胞分布均匀,得到更好的观察结果;
(4)如果实验需要做大容量的,或者做长时间的活细胞观察的,IBIDI培养皿,底部比普通载玻片的成像效果要好,可以直接完成所有细胞操作和观察,这个有配套的盖子可以减少污染,杜绝蒸发,盖子可锁可不锁,锁上的话,蒸发率基本为零,适合长时间观察细胞;
(5)如果实验需要定期观察同一个细胞/重新找回某一个之前观察过的细胞,或计数细胞,有带计数格的培养皿和腔式载玻片(8孔的),只要记住细胞的坐标,每次都可以轻松找回同一个细胞,不像平常用记号笔标记的那么不准确,记号笔的痕迹还会影响观察;
(6)如果实验要做高通量的免疫荧光,比如药筛,有24孔板,96孔板,384孔,价格和市面的多孔板差不多,多孔板不需要包被,也不会有自发荧光,孔壁是黑色的,所以孔和孔之间的免疫荧光不会互相影响;
(7)这些耗材专门为共聚焦超分辨显微成像设计,效果很好;
(8)这些产品都是通过ibidi的专利物理方法ibiditreat处理,底部都是超薄亲水的,大多数种类细胞都可以直接贴壁生长的,不需要另外包被了;如果有特殊实验需求,可以自己再包被的(选择uncoated版本);



来源:广州科适特科学仪器有限公司
联系电话:020-38102730
E-mail:kosterpub@163.com

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