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circRNA再发IF=18.88高分文章--circRNA机制研究汇总
点击次数:2653 发布日期:2019-4-18  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负
circRNA再发IF=18.88高分文章--您想知道的circRNA机制研究,都在这儿……

文章导读
超强子调控circRNA-Nfix缺失诱导成年小鼠心肌梗死后再生
circRNAs正在成为心脏发育和疾病强有力的调节因子,但其在心脏再生中的作用仍然未知。鉴于此,作者与他的团队探究了与超增强子(SEs)相关的circRNA-Nfix在小鼠心肌梗死后再生过程中的功能,并探究了其调节心脏重塑的分子机制,并于2019年4月5日,将该成果发表在了circulation杂志(IF=18.88)中。在本研究中,作者首先利用生物信息学分析RNA测序数据并结合SE目录,识别与SE相关的circRNAs,并利用qPCR和原位杂交技术检测发现发现circNfix在人类、大鼠和小鼠的成年心脏中过表达。然后通过在心肌梗死(MI)后心肌细胞(CM)中干扰或过表达circNfix,探究其对细胞增殖和心肌修复过程中的作用,并发现下调circNfix能够促进心肌梗死后CM增殖和血管生成,并抑制CM凋亡,减轻心功能障碍,改善预后效果。最后作者利用染色质免疫沉淀法(ChIP)和电泳迁移率转移法(EMSAs)方法测定转录因子Meis1与能够与circ-nfix的SE结合;利用RNA pull-down和荧光素酶报告基因分析方法研究circRNA与蛋白质或与miRNA的相互作用;发现下调circNfix能够增强Ybx1与Nedd4l (E3泛素连接酶)的相互作用,并诱导Ybx1发生泛素化降解,抑制下游cyclin-A2和cyclin-B1的表达。此外, circNfix还作为ceRNA,吸附mir-214并促进Gsk3β表达和抑制β-catenin活性。即:SE调控的circNfix缺失通过抑制Ybx1泛素依赖降解,增加miR-214活性,促进心肌梗死后心脏再生修复和功能恢复,可能是改善心肌梗死预后的一个有前景的策略。
技术路线
1 筛选并识别CircNfix
CircNfix是一种保守的心脏circrna。CircRNA的RPM表达水平(A)。CircNfi和circSlc8a1分别在P7小鼠和大鼠心肌细胞(CMs)和成纤维细胞(CFs)中的表达(B)。C-F.鉴定为环状RNA。qPCR检测 在鼠各种组织(G)、鼠心脏原代分析的各种细胞(H)、不同时间段的小鼠心脏组织(I)、不同时间段的小鼠心脏组织分离的心肌细胞(J)。ISH(K)和相应的分析(L-M)检测CircNfix在人、大鼠、小鼠心脏的表达。核质分离PCR(N)和FISH(O)检测CircNfix的亚细胞定位。
2 探究CircNfix的功能
(1)CircNfix下调促进了CM的增殖:Ki67免疫荧光(A)、EdU染色(B)、PH3免疫荧光(C)和Aurora B免疫荧光(D)检测干扰CircNf对P7 CM的增殖能力的影响。荧光线粒体染料四甲基罗丹明乙酯(TMRE)检测干扰CircNf对CM的分裂能力的影响(E)。Ki67免疫荧光(F)、EdU染色(G)和PH3免疫荧光(H)检测过表达CircNf对P0 CM的增殖能力的影响。对Nkx2.5、α-SMA、RUNX1、DAB2进行免疫荧光染色检测P7 CM去分化能力(I)。流式细胞术分析干扰CircNf对CM的细胞周期的影响(J)。
(2)circNfix下调可诱导心肌梗死后心脏再生:心肌梗死前、梗死后1、14、28天超声心动图分析心功能(A)。射血分数的定量分析(EF)及缩短分数(FS)(B-C)。小鼠体内转染sh-circnfixo28天后的小鼠心脏得分(D)。心肌梗死后14、28天小鼠心室横切面TTC染色(E)。心肌梗死后14天和28天Masson染色的心脏切片代表性图像(F)。心脏切片中纤维化区域的定量分析(G)。心肌梗死后shcircNfix组Kaplan-Meier生存曲线分析(H)。
3 探究CircNfix的分子机制
转录因子:
(1)转录因子Meis1通过结合Nfix位点的SE驱动circNfix表达:H3k27ac、H3k4me1和H3k27me3在人心脏组织Nfix位点的ChIP-seq谱(云序生物提供该服务)(A)。H3k27ac、H3k4me1、H3k27me3、P300、DNA超敏(DHS)、Meis1及PhastCons在小鼠心脏组织Nfix位点的保守性评分,以及小鼠CMs中H3k27ac ChIP-seq(云序生物提供该服务)(B)。SE与circNfix启动子区looping事件的3C-qPCR分析(C)。四种成分增强子(E1、E2、E3、E4)构建的pgl3启动子报告载体荧光素酶检测(D)。Meis1沉默后P7 CMs中野生型E2和突变E2的荧光素酶活性(E)。circNfix-SE中孵育Meis1结合位点被DIG-ddUTP标记寡核苷酸探针后,P7 CMs中提取的核蛋白的EMSA结果(F)。ChIP-qPCR(云序生物提供该服务)检测显示Meis1结合位点在circNfix-SE中扩增(G)。QRT-PCR检测Meis1基因敲除后P7 CMs中circNfix和Nfix mRNA的表达水平(H)。RNA FISH 检测Meis1基因敲除后P7 CMs中circNfix的亚细胞定位(I)。EdU染色检测Meis1和circNfix干扰后对P7 CMs增殖的影响(J)。
结合蛋白:
(2)CircNfix与Ybx1结合并促进其降解:circNfix和对照组的蛋白质谱分析(A)。采用Ybx1、Nedd4l或阴性IgG抗体进行RIP实验(云序生物提供该服务)(B)。P0 CMs中过表达circNfix后Ybx1蛋白表达水平(C-D)。qRT-PCR检测P0 CMs中Ybx1 mRNA表达水平(E)。RNA FISH在P0 CMs中过表达和不表达circNfix时, circNfix和Ybx1的亚细胞共定位(F)。分馏实验表明,circNfix过表达促进了Ybx1在细胞质中的易位,增加了Ybx1在细胞质中的降解(G)。在circNfix和Ybx1干扰后,细胞周期蛋白A2和细胞周期蛋白B1的表达水平(H)。ChIP-qPCR(云序生物提供该服务)检测显示,cyclin A2和cyclin B1启动子中Ybx1结合位点扩增(I)。细胞裂解物用抗Ybx1抗体免疫沉淀,用泛素(Ub)特异性抗体、抗Ybx1抗体或抗nedd4l抗体免疫印迹分析进行WB分析。过表达circNfix的CMs中Ybx1蛋白表达水平(K-L)。
ceRNA机制:
(3)circNfix与miR-214的相互作用:预测miR-214和miR-761能够与circNfix结合(A)。成年小鼠心脏中下调circNfix后,miR-214和miR-761的表达(B)。双荧光报告实验检测miR-214和circNfix能够直接结合(C)。RNA pull-down(云序生物提供该服务)实验检测circNfix能够拉下miR-214(D)。RNA FISH实验检测P0 CMs中,miR-124和circNfix能够共定位在胞质中(E)。RNA FISH实验检测P0 CMs中,miR-124和Gsk3β能够共定位在胞质中(F)。双荧光报告实验检测miR-214和Gsk3β 3’UTR直接结合(G)。WB检测干扰circNfix后Gsk3β蛋白的表达水平(H)。WB检测干扰或过表达miR-124后Gsk3β蛋白的表达水平(I)。WB检测干扰circNfix和miR-214后Gsk3β蛋白的表达水平(J)。CMs中,干扰circNfix后β-catenin的表达水平(K)。CMs中,干扰Meis1后Meis1和 Gsk3β的表达水平(L)。CMs中,干扰Meis1和circNfix后GSK3β的表达水平(M)。干扰circNfix, Ybx1, miR-214 和 Gsk3β后,P7 CMs进行pH3 和 Aurora B免疫染色(N)。
总结
circNfix如何通过与Ybx1和miR-214结合来调控心脏再生过程:转录因子Meis1与circNfix的SE结合后,抑剂circNfix的表达,缺失的circNfix能够增强Ybx1与Nedd4l (E3泛素连接酶)的相互作用,并诱导Ybx1发生泛素化降解,并进一步抑制下游cyclin-A2和cyclin-B1的表达。同时,缺失的circNfix能够,降低对miR-214的吸附,进一步抑制Gsk3β及VEGF的表达,最终促进心肌梗死后心脏再生修复和功能恢复。
全文链接:
https://www.ahajournals.org/doi/pdf/10.1161/CIRCULATIONAHA.118.038361
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